大劣按蚊抗約氏瘧原蟲感染相關蛋白的研究 | 約氏瘧原蟲
請輸入搜索內容知識節點基本信息摘要關鍵詞基金導師分類號文內圖片知識網絡引文網絡關聯作者相似文獻讀者推薦主題指數相關基金文獻大劣按蚊抗約氏瘧原蟲感染相關蛋白的研究王英第三軍醫大學導出/參考文獻已關注關注X關注成功！加關注后您将方便地在我的關注中得到本文獻的被引頻次變化的通知！你還可以通過其他方式得到推送信息>>收藏打印評論摘要：瘧疾目前仍是嚴重危害人類健康的一種寄生蟲病,每年導致100～300萬人死亡。
近年來,瘧原蟲抗藥性和蚊媒耐藥性的產生和迅速擴散,加之有效瘧疾疫苗的缺乏,給瘧疾防治工作帶來很大的困難。
傳統方法已難于控制該病的流行,迫切需要為瘧疾的防治工作提供新的方法和治療靶點。
通過對瘧原蟲在蚊體內發育過程中關鍵環節的干擾來阻斷瘧疾的傳播,是控制瘧疾的一類有價值的新策略。
而這一策略的實施需要對蚊與瘧原蟲之間的復雜關系有著比較詳細的了解,尤其是蚊抗瘧原蟲感染和瘧原蟲在蚊體內發育所需的一些關鍵分子的鑒定至關重要。
抗菌肽的產生、細胞吞噬作用和黑化包被反應是蚊抗瘧原蟲感染中最為重要的三類免疫反應,對其相關分子的鑒定具有重要意義。
其中,黑化包被反應是按蚊的一種有效的抗瘧機制,反應的某些關鍵成分(如絲氨酸蛋白酶)來源于血淋巴。
目前關于蚊抗瘧原蟲感染分子機制的研究主要集中于岡比亞按蚊,對大劣按蚊的研究甚少。
大劣按蚊是我國及東南亞地區的主要傳瘧媒介,能夠通過卵囊黑化包被的方式殺傷其體內的約氏瘧原蟲,從而阻斷對該瘧原蟲的傳播。
因此,大劣按蚊-約氏瘧原蟲是一個很好的研究模型,利用該模型可以開展瘧疾蚊媒阻斷策略及醫學昆蟲免疫的相關研究。
本研究即是利用二維電泳(TwoDimensionalElectrophoresis,2DE)、原核表達、westernblot、RT-PCR、實時熒光定量PCR(Real-timePCR)、免疫組化、激光共聚焦等技術對大劣按蚊血淋巴中抗約氏瘧原蟲感染相關蛋白進行分離、鑒定,并對絲氨酸蛋白酶進行相關研究。
整個研究分為三大部分:第一部分:篩選和鑒定大劣按蚊感染約氏瘧原蟲后血淋巴相關蛋白,并對該相關蛋白的生物學作用進行分析。
1、利用2DE技術較好地分離了感染約氏瘧原蟲前后的血淋巴蛋白,比對后獲得37個差異蛋白點。
2、對感染前后的部分差異蛋白(DEP1～6)進行質譜分析,并對DEP1進行N端氨基酸測序,根據檢測結果在蛋白質數據庫中進行檢索、分析和生物學特性的預測。
結果顯示,DEP1～6均為尚無研究的未知蛋白,其中DEP1可能在蚊抗瘧原蟲感染中起著重要作用。
第二部分:對大劣按蚊絲氨酸蛋白酶3(AdSP3)進行原核表達,并檢測表達產物與煙草天蛾前酚氧化酶活化酶(PAP)抗血清之間的免疫反應性,同時進行生物信息學分析,以明確利用煙草天蛾PAP抗血清研究大劣按蚊絲氨酸蛋白酶的可行性。
隨之,利用煙草天蛾PAP抗體,對電泳分離的血淋巴蛋白進行了鑒定和與瘧原蟲感染的相關性研究。
1、成功構建了大劣按蚊絲氨酸蛋白酶Pinpoint/AdSP3表達質粒,并在JM109大腸桿菌中進行原核表達,表達獲得了一35kDa大小的融合蛋白。
Westernblot檢測結果顯示,煙草天蛾PAP抗血清與大劣按蚊絲氨酸蛋白酶具有免疫反應性。
對昆蟲絲氨酸蛋白酶進行生物信息學分析顯示,大劣按蚊絲氨酸蛋白酶與煙草天蛾PAP之間的氨基酸序列有較高同源性,且關鍵位點保守。
本研究提示,利用煙草天蛾PAP抗血清識別大劣按蚊絲氨酸蛋白酶可行。
2、利用煙草天蛾PAP抗血清,結合SDS-PAGE、2DE和Westernblot技術,對大劣按蚊感染約氏瘧原蟲前后血淋巴中的絲氨酸蛋白酶進行分離、識別和鑒定。
結果顯示,在大劣按蚊血淋巴蛋白中有分子量不同的兩個蛋白能與PAP抗血清反應,且感染前后的差異提示該蛋白可能與瘧原蟲的感染相關。
第三部分:從mRNA水平和蛋白水平分別對大劣按蚊絲氨酸蛋白酶進行組織定位和定量研究。
1、利用RT-PCR和Real-timePCR技術從mRNA水平對絲氨酸蛋白酶在蚊體內進行組織定位和定量研究。
結果顯示,血淋巴細胞和唾液腺中有絲氨酸蛋白酶AdSP3的表達,而蚊胃中則難以確定有無該酶的表達;感染前后及吸血后的不同時相點絲氨酸蛋白酶AdSP3的轉錄水平不同,其變化可能與瘧原蟲的感染有關。
2、從蛋白水平利用免疫組化技術和激光共聚焦技術,確定絲氨酸蛋白酶在大劣按
近年來,瘧原蟲抗藥性和蚊媒耐藥性的產生和迅速擴散,加之有效瘧疾疫苗的缺乏,給瘧疾防治工作帶來很大的困難。
傳統方法已難于控制該病的流行,迫切需要為瘧疾的防治工作提供新的方法和治療靶點。
通過對瘧原蟲在蚊體內發育過程中關鍵環節的干擾來阻斷瘧疾的傳播,是控制瘧疾的一類有價值的新策略。
而這一策略的實施需要對蚊與瘧原蟲之間的復雜關系有著比較詳細的了解,尤其是蚊抗瘧原蟲感染和瘧原蟲在蚊體內發育所需的一些關鍵分子的鑒定至關重要。
抗菌肽的產生、細胞吞噬作用和黑化包被反應是蚊抗瘧原蟲感染中最為重要的三類免疫反應,對其相關分子的鑒定具有重要意義。
其中,黑化包被反應是按蚊的一種有效的抗瘧機制,反應的某些關鍵成分(如絲氨酸蛋白酶)來源于血淋巴。
目前關于蚊抗瘧原蟲感染分子機制的研究主要集中于岡比亞按蚊,對大劣按蚊的研究甚少。
大劣按蚊是我國及東南亞地區的主要傳瘧媒介,能夠通過卵囊黑化包被的方式殺傷其體內的約氏瘧原蟲,從而阻斷對該瘧原蟲的傳播。
因此,大劣按蚊-約氏瘧原蟲是一個很好的研究模型,利用該模型可以開展瘧疾蚊媒阻斷策略及醫學昆蟲免疫的相關研究。
本研究即是利用二維電泳(TwoDimensionalElectrophoresis,2DE)、原核表達、westernblot、RT-PCR、實時熒光定量PCR(Real-timePCR)、免疫組化、激光共聚焦等技術對大劣按蚊血淋巴中抗約氏瘧原蟲感染相關蛋白進行分離、鑒定,并對絲氨酸蛋白酶進行相關研究。
整個研究分為三大部分:第一部分:篩選和鑒定大劣按蚊感染約氏瘧原蟲后血淋巴相關蛋白,并對該相關蛋白的生物學作用進行分析。
1、利用2DE技術較好地分離了感染約氏瘧原蟲前后的血淋巴蛋白,比對后獲得37個差異蛋白點。
2、對感染前后的部分差異蛋白(DEP1～6)進行質譜分析,并對DEP1進行N端氨基酸測序,根據檢測結果在蛋白質數據庫中進行檢索、分析和生物學特性的預測。
結果顯示,DEP1～6均為尚無研究的未知蛋白,其中DEP1可能在蚊抗瘧原蟲感染中起著重要作用。
第二部分:對大劣按蚊絲氨酸蛋白酶3(AdSP3)進行原核表達,并檢測表達產物與煙草天蛾前酚氧化酶活化酶(PAP)抗血清之間的免疫反應性,同時進行生物信息學分析,以明確利用煙草天蛾PAP抗血清研究大劣按蚊絲氨酸蛋白酶的可行性。
隨之,利用煙草天蛾PAP抗體,對電泳分離的血淋巴蛋白進行了鑒定和與瘧原蟲感染的相關性研究。
1、成功構建了大劣按蚊絲氨酸蛋白酶Pinpoint/AdSP3表達質粒,并在JM109大腸桿菌中進行原核表達,表達獲得了一35kDa大小的融合蛋白。
Westernblot檢測結果顯示,煙草天蛾PAP抗血清與大劣按蚊絲氨酸蛋白酶具有免疫反應性。
對昆蟲絲氨酸蛋白酶進行生物信息學分析顯示,大劣按蚊絲氨酸蛋白酶與煙草天蛾PAP之間的氨基酸序列有較高同源性,且關鍵位點保守。
本研究提示,利用煙草天蛾PAP抗血清識別大劣按蚊絲氨酸蛋白酶可行。
2、利用煙草天蛾PAP抗血清,結合SDS-PAGE、2DE和Westernblot技術,對大劣按蚊感染約氏瘧原蟲前后血淋巴中的絲氨酸蛋白酶進行分離、識別和鑒定。
結果顯示,在大劣按蚊血淋巴蛋白中有分子量不同的兩個蛋白能與PAP抗血清反應,且感染前后的差異提示該蛋白可能與瘧原蟲的感染相關。
第三部分:從mRNA水平和蛋白水平分別對大劣按蚊絲氨酸蛋白酶進行組織定位和定量研究。
1、利用RT-PCR和Real-timePCR技術從mRNA水平對絲氨酸蛋白酶在蚊體內進行組織定位和定量研究。
結果顯示,血淋巴細胞和唾液腺中有絲氨酸蛋白酶AdSP3的表達,而蚊胃中則難以確定有無該酶的表達;感染前后及吸血后的不同時相點絲氨酸蛋白酶AdSP3的轉錄水平不同,其變化可能與瘧原蟲的感染有關。
2、從蛋白水平利用免疫組化技術和激光共聚焦技術,確定絲氨酸蛋白酶在大劣按